Um Gene zu erforschen, muss man sie zerstören. Nahezu alles, was wir über die Funktion verschiedener Erbgutabschnitte wissen, haben Forscher herausgefunden, indem sie diese Gene ausgeschaltet und die Folgen untersucht haben. Grundlage dafür ist die Knockout-Technik, für die Martin Evans, Mario Capecchi und Oliver Smithies 2007 den Nobelpreis erhielten. Doch Knockouts haben einen Nachteil: Sie funktionieren nur bei Mäusen. Bei anderen Lebewesen gibt es bisher kein allgemeines Verfahren, Gene gezielt auszuschalten. Das macht Genforschung an Ratten, Krallenfröschen oder Lanzettfischen zu einer komplizierten und oft frustrierenden Angelegenheit.

Bisher jedenfalls. Denn seit Kurzem gibt es mit TALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) und Zink-Finger-Nukleasen (ZFN) zwei Verfahren, die dieses Problem elegant lösen. Beide verwenden Proteinkonstrukte mit speziellen Schneideproteinen, den Nukleasen, die den DNA-Strang an einer ausgewählten Stelle kappen. Der eigentliche Trick liegt in der zweiten Komponente: Proteinstrukturen, die so verändert werden können, dass sie beliebige DNA-Sequenzen ganz genau erkennen und binden.

Dass Proteine DNA-Sequenzen binden können, ist nicht neu. Doch bisher sind sie dabei zu genau: Man kann sie nicht einfach an ein, zwei Stellen umbauen, damit sie an eine auch nur leicht veränderte Sequenz passen. Selbst für eine minimal andere Basenabfolge braucht man ein völlig neues Eiweiß-Molekül. #

Die neuen Konstrukte jedoch entstehen in Modulbauweise: Sie enthalten mehrere DNA-bindende Proteinteile, die gemeinsam die Bindungsstelle für eine Sequenz bilden. Ist ein Teil der DNA etwas anders, tauscht man das zugehörige Modul aus, und es passt wieder.

Baukastensystem für das gezielte K.O.

Im Fall der ZFN sind die Module die namensgebenden Zinkfinger – schleifenförmige, von Zinkatomen im Zentrum zusammengehaltene Eiweißstrukturen, deren Ende in die Rille des DNA-Doppelstranges passt und dort abhängig von den berührten Basenpaaren unterschiedlich stark bindet. Ein einzelner Zinkfinger bindet je drei Basen, und ein ZFN enthält etwa drei bis sechs Finger. Theoretisch kann man den DNA-bindenden Teil einfach aus zur gewünschten Sequenz passenden Fingern zusammensetzen.

Bislang tauchen dabei noch erhebliche Schwierigkeiten auf, die dazu führen, dass ZFN zwar seit Mitte der neunziger Jahre erforscht werden, bislang aber gemessen an ihren Möglichkeiten nur geringe Bedeutung erlangt haben. Die einzelnen Zinkfinger beeinflussen sich gegenseitig, sodass ein Molekül, das theoretisch perfekt auf eine Sequenz zugeschnitten ist, in der Praxis oft nicht so ideal bindet wie gewünscht. Zinkfinger-Nukleasen müssen also trotz des einfachen Bausatzprinzips aufwändig optimiert werden. Entsprechend teuer sind sie. ihr Einsatz braucht lange Vorlaufzeiten.

Dieser Nachteil fällt bei der zweiten Variante, den TALEN weg. Sie wurden erst vor wenigen Jahren im Genom von Bakterien Gattung Xanthomonas entdeckt.

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Das Funktionsprinzip ähnelt denen der Zinkfinger – auch TALEN bestehen aus einer Abfolge von Modulen, die gemeinsam an eine Sequenz binden. Jedes Modul besteht aus der gleichen Aminosäuresequenz, die sich nur an einer Stelle unterscheidet, der DNA-Bindungsstelle. Sie ist für genau ein Basenpaar spezifisch. Anders als die Zinkfinger lassen sich diese vier Module beliebig kombinieren, ohne sich zu stören. Und die Nuklease zerschneidet das Erbgut genau an der Stelle zwischen den beiden Erkennungssequenzen.

Einen festen Platz im Werkzeugkasten

Wegen dieser Vorteile haben sich die TALEN einen festen Platz im Repertoire von Molekularbiologen erobert. "Mit den TALEN funktioniert das alles sogar sehr einfach", erklärt Alexander Knoll vom Karlsruhe Institute of Technology. Er forscht an Genen der Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana, die zur Reparatur von DNA-Schäden beitragen. Um bei dieser Pflanze Mutationen zu erzeugen, nutzte man bisher einen natürlichen Mechanismus aus: die Infektion mit dem Bakterium Agrobacterium tumefaciens. Dazu baut man ein Stück seiner DNA an einer zufälligen Stelle in das pflanzliche Genom ein und kann so – wenn es der Zufall will – auch ein Gen inaktivieren. Einen solchen Zufallstreffer zu landen, ist aber sehr aufwändig und klappt nicht immer.

Die Einzelteile können Genetiker kaufen

"Ich kann nun heraussuchen, wo genau ich die Mutation haben will, und zwar basengenau im Genom", erklärt Knoll die Vorteile von TALEN gegenüber dem älteren Verfahren. "Ich kann mir damit auch echte Knockout-Mutanten erzeugen, bei denen das gesamte Gen im Genom fehlt, sonst aber nichts zusätzlich im Genom ist." Die dafür nötigen TALEN erzeugt er selbst. Im Handel sind Genabschnitte erhältlich, die alle Komponenten des Werkzeugs kodieren, insbesondere auch die einzelnen TALE-Module. Die Einzelteile setzt der Wissenschaftler zusammen und überträgt sie in das hilfreiche Agrobacterium tumefaciens, welches das TALEN-Gen in das Genom der Pflanze einbaut. Das geschieht nach wie vor zufällig, doch das entstehende Protein schneidet mit seinem Nuklease-Teil exakt an der gewünschten Stelle im Genom.

Ist das geschehen, hilft die Zelle selbst, die gewünschten Mutationen zu erzeugen. Den künstlich verursachten Doppelstrangbruch repariert die Zelle sofort, doch sie macht dabei oft Fehler, sodass das angepeilte Gen oft unbrauchbar wird. Auch hier ist also Zufall im Spiel, aber die Trefferwahrscheinlichkeit ist viel höher als bei herkömmlichen Methoden. Anschließend, erklärt Knoll, züchte er das TALEN-Gen aus den Mutanten heraus und erhalte eine Pflanze mit der gewünschten Mutation.

Das Charmante an dem Verfahren ist, dass es, anders als der Knockout von Genen, bei allen Organismen funktioniert. Bei Tieren reicht es sogar aus, die fertigen Proteine in den Embryo oder das erwachsene Tier einzuschleusen. Inzwischen haben Wissenschaftler auf diese Weise Mutationen in Ratten, Zebrabärblingen und anderen Versuchstieren erzeugt und das Verfahren sogar zur Forschung an menschlichen Stammzellen eingesetzt.

Prinzipiell sollte es auch möglich sein, mithilfe dieser Methoden neue Erbgutbestandteile ins Genom einzufügen. Dabei hilft die homologe Rekombination, ein weiterer Mechanismus zur Reparatur von DNA-Schäden. Trifft das abgetrennte DNA-Ende nämlich auf einen Einzelstrang, von dem ein Teil zum Doppelstrang passt, lagern sich der neue Strang und der dazu passende Strang mit den zueinander passenden Sequenzen aneinander, und die neu hinzugekommene DNA dient als Vorlage für die Vervollständigung des durchtrennten Erbgutstranges. Zusätzlich zu den Nuklease-Konstrukten, so der Plan, soll in Zukunft ein DNA-Einzelstrang in die Zelle gebracht werden, dessen Enden zu den Sequenzen auf beiden Seiten der Lücke im Genom passen.

Schreibmaschinen fürs Genom

Der Mittelteil enthält die Erbgutsequenz, die man einfügen möchte. Die Zelle schließt dann nicht nur die Lücke im Genom, sondern baut auch noch das gewünschte Stück Fremderbgut ein: Damit könnte man im Genom schreiben wie in einem Textverarbeitungsprogramm.

Bei allen Erfolgen müssen die Nuklease-Konstrukte erst noch zeigen, wozu sie wirklich fähig sind. Sind sie tatsächlich so präzise, wie es bisher den Anschein hat? Könnten sie das Genom in seltenen Fällen vielleicht doch an der falschen Stelle zerschneiden? Ihre Entwicklung steht erst am Anfang. Die Folgen der neuen Möglichkeiten sind schon heute kaum mehr zu überblicken.

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